金线莲(Anectochilus roxburhii)，在民间具有很高评价，被誉为“金草”、“药王”等，其临床应用效果显著，但生长周期慢、资源稀少且价格昂贵，因此金线莲正品在药材市场和分子植物育种配伍使用时，常出现同属伪品冒充或混用的情况。目前，中药材的鉴定主要从形态特征、显微结构和理化性状等方面区分，由于中药材受生长环境和炮制方法的影响，加之不法商贩为追求高利润掺杂掺假，单从外观上很难准确判断，这也为金线莲的鉴定增加了难度。因此，寻找快速、可靠而简便的鉴定方法势在必行，这不仅有利于金线莲资源的保护和开发，也为其临床应用提供了保障。 DNA 条形码技术是由 首次提出，它是一种利用短的、标准的 DNA 片段来鉴定物种的技术，受到研究者们广泛的关注。植物 DNA 条形码技术是对植物基因组中的特定基因片段进行扩增、测序而发现其碱基变化规律的鉴定手段。近 10 年左右，DNA 条形码成为(生物学)研究的热点之一,并在动物界广泛应用(Gregory, 2005)。然而，在植物界，至今还未能找到具有高通用性和高鉴定能力的、能够覆盖所有植物的 DNA 序列(Pettengill and Neel, 2010; 任保青和陈之瑞, 2010)。在第三届国际植物生命条形码大会上，国际植物条形码组织推荐 matK 和 rbcL 序列作为核心条形码序列, psbA-trnH 和 ITS/ITS2 作为补充序列(CBOL Plant Working Group, 2009)。随后，Chen 等(2010)通过对 7 个候选 DNA 条形码(psbA-trnH, matK,rbcL, rpoC1, ycf5, ITS2, ITS)的研究比较，首次在药用植物领域提出 ITS2 为最佳 DNA条形码，psbA-trnH为补充序列因此，本研究对 32 个金线莲资源样品的四个 DNA 条形码(ITS, rbcL, psbA-trnH, matK)序列进行 PCR扩增和测序，结合 Genbank 下载了金线莲及其 3 种主要混伪品的 29 条序列，分析比较各序列的差异位点、信息位点、GC 含量等，并进行种内和种间的遗传距离计算，构建基于 K2P 模型的 NJ 系统发育树，综合比较不同序列的鉴定能力，最终从四个 DNA 条形码候选序列中筛选出可用于金线莲资源鉴定的通用序列。结果显示，通过对序列的种内、种间的差异位点分析和遗传距离分析，ITS 和 psbA-trnH 序列的种内、种间的变异位点差异和遗传距离差异较 rbcL 和 matK 序列具有显著优势，且 ITS 序列不仅能够快速而准确区分金线莲及其混伪品，而且能够在种内水平上区分金线莲。因此，ITS 可以作为金线莲种内、种间鉴定理想的条形码。本研究为快速鉴定金线莲提供了方法依据，同时 DNA 条形码也弥补了形态学鉴定的不足，为金线莲在其他的研究、开发方面提供理论指导和帮助。 1 结 果与分析本研究中从收集的 32 个金线莲资源中获得 128 条序列，所有序列均 100%扩增成功，且所有获得的序列经 NCBI 数据库相似检索均较好的匹配。 1.1 序列信息分析通过对测序结果的序列长度、GC 含量、平均变异位点数、信息位点数、转换与颠换比等序列特点的比对分析(表 1)，可以看出各序列长度由大到小分别为：matK> psbA-trnH> ITS> rbcL；GC 的含量由大到小为：ITS> rbcL> psbA-trnH> matK；转换与颠换比为：ITS> matK> psbA-trnH> rbcL；结合序列长度和变异位点的百分比来看，psbA-trnH 序列具有较大的变异性，其次是 ITS，变异性较小的是 matK 和 rbcL；从序列长度和简约信息位点的百分比来看，ITS 含有较多的信息位点，其次是 matK 和 psbA-trnH，rbcL 的信息位点最少。 1.2 种内和种间遗传距离分析通过对种内、种间遗传距离的计算分析 (表 2)，从种间平均距离和种间最小遗传距离来看 ITS> psbA-trnH> matK> rbcL；从种内平均距离和种内最大遗传距离来看 matK> psbA-trnH> ITS> rbcL。从种间遗传距离的两个参数可知，ITS 和 psbA-trnH 两个序列的遗传距离明显大于其他两个序列，从种内遗传距离的两分子植物育种Molecular Plant Breeding个参数可知，ITS 序列和 psbA-trnH 序列的遗传距离明显小于 matK 序列和 rbcL 序列。 表 2 种内, 种间遗传距离分析1.3 NJ 系统树的构建通过 NJ 系统发育树分别对四个候选条形码的序列进行分析比较(图 1)，NJ 树具有较强的图解表示法来识别不同的种类，是比较理想的分析方法，尤其适合于相近种源。本研究基于 K2P 模式建立的四个候选序列的 NJ 树，聚类结果显示，ITS (图 1A)和 psbA-trnH (图 1C)序列对金线莲及其混伪品有较高的分辨能力，能将他们聚类到各自的分支，尤其是 ITS 还能在种内水平上区分金线莲；matK (图 1B)仅能将金线莲单独聚为一支，而将血叶兰和斑叶兰聚为另一支；rbcL (图 1D)序列不能将金线莲及其混伪品区分，它的分辨能力最低。 图 1 四个候选序列的 NJ 系统发育树注: 分支处的数字代表系统树的自展值(>=50%); A: ITS; B: matK; C: psbA-trnH; D: rbcLFigure 1 The four phylogenetic trees are constructed using NJ method分子植物育种2 讨论本研究中所选择的 4 个条形码，符合第三届国际 DNA 条形码会议的标准(CBOL Plant Working Group,2009)；据文献，理想的 DNA 条形码必须同时满足种间变异大、种间变异小、最小种间变异大于最大种内变异(郑司浩等, 2014)。从序列特征可以看出，ITS 和 psbA-trnH 两个候选序列的变异位点和简约信息位点比其他两个序列多；从遗传距离的分析可以看出，ITS 和 psbA-trnH 的种间最小遗传距离远大于种内最大遗传距离，尤其是 ITS 序列更有优势，满足理想的 DNA 条形码要求；另外两个候选序列 matK 和 rbcL 表现不佳，可能因为他们是叶绿体基因，由于叶绿体基因是母系遗传且保守性强(Hidalgo et al., 2004)，于此产生的差异位点及构建的系统进化关系不能有效区分金线莲及其混伪品。从 NJ 系统树的聚类结果也显示出，ITS 和 psbA-trnH 有较好的聚类效果，而且 ITS 序列不仅能区分金线莲及其混伪品，还能够区分金线莲的不同品种。由于基因库中未登录金线莲 psbA-trnH 基因的参考序列，所以对于此序列能否在种内水平鉴定金线莲还不确定，但是有学者指出，psbA-trnH 序列对桤木(Alnus)的不同品种具有很高的分辨能力相比另外两个条形码，matK 不能在种内水平上区分金线莲；rbcL 显示出更低的聚类效果，既不能区分不同品种的金线莲，也不能在种间水平上区分开唇兰属、斑叶兰属和血叶兰属。尽管有学者认为 matK是叶绿体基因中进化最快的、具有较高的变异(Chase et al., 2007; Lahaye et al., 2008)、且进化率在 ITS 和rbcL 之间，也有报道 matK 基因能够对药用石斛、重楼属及仙人掌等植物进行准确的鉴定(吴育鹏等, 2016)；另有学者认为 rbcL 序列具有较好的扩增和比较的特性(Newmaster et al., 2006; Kress and Erickson, 2007)，rbcL 能够将 93 株大型海藻成功区分为 7 目 8 科 11 属 2 种(黄艳等, 2018)。但是，它们对于区分金线莲及其混伪品的效果不佳，不适宜作为鉴定金线莲资源的通用条形码。这一结论与前人的结果一致(Lahaye et al.,2008; Keller et al., 2009; Zhang et al., 2012)，也许是因为金线莲的叶绿体基因进化比较缓慢，而导致 matK和 rbcL 序列对该物种的鉴定能力下降，这可能是它们在近源物种群中表现不佳的主要原因。有学者利用 ITS 序列成功区分 36 份大型单子叶草本植物香蕉的不同品种(冯慧敏等, 2015)，罗小珍等(2016)利用 ITS 序列将 6 种十大功劳属植物成功聚类，说明核基因 ITS 具有较好的扩增和测序结果，使其具有较高的分辨能力，我们支持 ITS 作为金线莲资源鉴定的标准条形码，这一结果与 Lv 等(2015)的结果一致，当然这个需要在今后的试验和实践中不断验证。另外，psbA-trnH 也具有一定的潜力，我们需要补充和完善此条形码在基因库中参考序列。 众所周知，在药用植物领域，不同品种的有效成分含量具有较大的差异，且有效成分的含量决定了中药材的质量。有研究者对不同种金线莲的化学成分进行了研究，结果显示，保亭金线莲(A. roxburghii)的多糖和总黄酮含量高于其他品种，滇越金线莲(A. chapaensis)的总生物碱和氨基酸含量高于其他品种(谭嘉娜等, 2016)，这就要求研究者在有效成分和药理药效研究时合理的选材。但是，自然界中的植物受生长环境的影响，不同品种在同样的生境下会表现出相同的形态特性，只依靠形态特征去选择研究材料会有误差，ITS 序列可为其提供帮助。 总之，本研究筛选出的 ITS 条形码，可以作为理想的 DNA 条形码准确识别金线莲。在提倡产学研结合及让中医中药走向世界的背景下，本研究在金线莲的临床应用、功能成分分析、优良品种选育等方面具有一定的应用价值；同时，也为道地药材的鉴定提供方法，且不受药材炮制方法的影响，而且鉴定方法的重复性较高。我们将在今后结合中药指纹图谱归纳和完善有效成分与金线莲品种间的关系，更好的为科学研究和产业的发展提供帮助。